麻黄探针法荧光定量PCR试剂盒
价格:3490.00/ 盒
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品种名:麻黄探针法荧光定量PCR试剂盒 单只重:公斤以下 苗龄: 成活率:% 公母:
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麻黄探针法荧光定量RT-PCR试剂盒

Herba ephedrae 

产品及特点 

荧光定量PCR是在PCR体系中加入荧光化合物(荧光染料或荧光探针)。利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,使每个循环变得“可见”。本产品就是以探针法荧光定量 RT-PCR 技术为基础开发的专门检测麻黄的试剂盒。

产品名称

方法

规格

价格

麻黄LAMP试剂盒

LAMP

50

2490

麻黄PCR试剂盒

PCR

50

1490

麻黄染料法荧光定量PCR试剂盒

染料法

50

2490

麻黄探针法荧光定量PCR试剂盒

探针法

50

3490

它具有下列特点:

1. 即开即用,用户只需要提供样品RNA模板。

2. 引物和探针经过优化,灵敏性高。

3. 提供阳性对照,便于区分假阴性样品。

4. 特异性高,引物是根据麻黄高度保守区设计,不会跟其他病毒的RNA发生交叉反应。

5. 本产品足够 50 20μL 体系的探针法荧光定量 RT-PCR 反应。

6. 本产品只能用于科研。

 

规格及成分

成分

编号

十孔盒包装

探针法 qRT-PCR 缓冲液

A

500μL(黄盖)

探针法 qRT-PCR 酶混合液

B

100μL(红盖)

荧光 PCR 专用模板稀释液

C

1 mL(黄盖)

麻黄探针法 qRT-PCR引物混合液

D

100 μL(白盖)

麻黄 qRT-PCR 探针

E

50 μL(棕色管)

麻黄探针法 qRT-PCR阳性对照(1×10E8 拷贝/μL)

F

50 μL(黄盖)

核酸释释剂(试用装)

G

20 次(1mL,绿盖)

使用手册

H

一份

运输及保存 低温运输,-20℃保存,保存期限为12个月。

自备试剂 样品 RNA

使用方法

一、稀释标准曲线样品(以 10E2-10E7 拷贝/μL 6 10 倍稀释度为例)。由于标准品浓度非常高,因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行,千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分)。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原,本产品不提供活体样品做阳性对照,只提供无传染性的 DNA 片段作为阳性对照。

1. 标记 6 个离心管,分别为 765432

2. 用带芯枪头分别加入 45 μL 荧光 RT-PCR 专用模板稀释液,最好用带芯枪头,下同)。

3. 7 号管中加入 5 μL 1×10E8 拷贝/μL 的阳性对照(试剂盒提供),充分震荡1分钟,得 1×10E7 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。

4. 换枪头,在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得),充分震荡 1 分钟,得 1×10E6 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。

5. 换枪头,在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得),充分震荡1分钟,得 1×10E5 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。

6. 重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。

二、样品 RNA 的制备

7. 如果有N个样品,最好设置N+2个提取,多出的一个是PC(样品制备阳性对照),一个是 NC(样品制备阴性对照)。可以用10μL阳性对照的10000倍稀释液再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样,以此作为PC。另外用水作为NC

8. 用自选方法纯化样品的RNA,本试剂盒跟市场上大多数病毒RNA提取试剂盒兼容。也以选购本公司的柱式病毒RNAout。本试剂盒免费赠送20次免RNA提取的核酸释放剂试用装,该释放剂的裂解液可以直接作为RT-PCR模板,省略了RNA提取步骤。

三、Probe qRT-PCR 反应(20μL 体系,在样品制备室进行)

9. 如果做定量分析并且只做1次重复,则标记N+9PCR 管,其中N+2个用于上步得到的 N+2个样品,1个用于PCR阴性对照(用水做模板),6个用于标准曲线。如果做定性分析,并且只做1次重复,则标记N+4 PCR管,其中N+2个用于上步得到的N+2个样品,1 个用于 PCR 阴性对照(用水做模板),1个用于PCR阳性对照(用第4号管的阳性对照稀释液做模板)。下面只以定量分析为例描述操作步骤。

10. 在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照,并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加):

 

成分

样品管N+2

RT-PCR阴性对照管

标准曲线样品管

2-7 管)

探针法qPCR缓冲液

10 μL

10 μL

10 μL

探针法 qPCR 酶混合液

2 μL

2 μL

2 μL

麻黄qRT-PCR探针

1 μL

1 μL

1 μL

麻黄探针qRT-PCR

引物混合液

2 μL

 2 μL

2 μL

待测样品 RNA 模板

5 μL

--

--

超纯水

--

5 μL

--

7 步所得标准曲线样品稀释液(2-7 号)

--

--

5 μL2号样到2号管,3号样到3 号管…)

11. 盖上盖子后上机,按下面参数进行 qRT-PCR

过程

温度

时间

逆转录

50

30 min

预变性

94

10 min

qRT-PCR 反应(40 个循环)

94

15 sec

60

1 min(采集 FAM 通道的荧光信号)

五、数据处理

12. 如果把本试剂盒用于定量检测,则以阳性对照浓度的 log 值为横轴,以 Ct值为纵轴,绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品RNA 浓度的 log 值,再推算出其浓度。

13. 如果把本试剂盒用于定性检测,只判断阳性或阴性,则阴性对照 Ct 必须大于或等于 40。阳性对照必须有荧光对数增长,有典型扩增曲线,Ct 值应该小于或等于 30。对待测样品,如果其 Ct 大于或等于 40 则为阴性,如果小于或等于 35 则为阳性。如果在 35-40 之间,则重复一次。重复实验的 Ct值如果大于或等于 40 则为阴性,如果小于 35,则为阳性。

六、常见问题与解决方法:

常见问题

可能原因

解决方法

 

 

阳性对照、待测样本均无条带。

PCR反应体系或反应条件不合适。

使用梯度PCR摸索PCR反应条件。

PCR试剂保存不当失去活性。

2× PCR Mix应保存于-20℃,使用时避免反复冻融。若使用频繁,可在4℃短时间存放。

引物设计问题。

尝试重新设计引物进行检查。

 

 

 

 

 

 

阳性对照有目的条带,待测样本无条带或条带弱。

不当储存或长期储存引起试剂活性丧失。

使用新鲜的试剂。

加入组织裂解液过量。

增大反应体系,或减少裂解液的用量。

样本裂解混合液保存不当或保存时间过久,DNA基因组已经降解。

裂解混合液液可在4℃保存2-3天,尽量使用新制备的裂解液混合液进行PCR

模板加入量不适合。

在反应体系10-20%范围内优化模板加入量。反应效性能较差时,可以降模板浓度调节到低于10%的范围。

PCR循环数不足。

适当增加PCR的循环数,推荐在35-40循环为佳。因为模板复杂,一般PCR反应要比用纯化的 DNA模板多5-10个循环为佳。

 

 

 

非特异性扩增

PCR退火温度太低,循环数、引物浓度或模板浓度太高。

增加PCR退火温度,降低PCR循环数、引物浓度或模板浓度。

PCR引物错配。

重新设计PCR引物。

配制PCR反应体系时温度太高或配制完成后放置时间太久。

PCR反应体系的配制在低温下进行,配制完成后尽快进行PCR扩增反应。

 

 

 

阴性对照出现目的条带

操作工具或试剂污染。

实验所有试剂或器材均应高压灭菌。操作时应小心轻柔,防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。

样本间交叉污染。

每个取样器只对一个样本使用;或取完一个样本后,将取样器刃口浸入2%的次氯酸钠溶液中,反复涮洗,然后用干净的纸巾擦干残液。